荧光定量PCR（Real-time PCR）是一项重要的生物医疗技术，主要通过在PCR扩增反应中添加荧光基团，实现对每个扩增循环产物的实时荧光信号监测，并最终利用标准曲线对未知模板进行定量分析。以探针法荧光定量PCR为例，在PCR扩增过程中，我们同时加入一对引物和一个特异性的荧光探针。该探针的两端分别连接一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。起初，探针完整结合在目标DNA链上，报告基团发射的荧光信号会被淬灭基团所吸收，因此无法检测到荧光信号。在PCR扩增中，Taq酶对探针降解，导致报告基团与淬灭基团分开，系统便能接收到荧光信号，实现了荧光信号的累计与PCR产物的形成同步进行。

与传统PCR相比，传统方法在扩增后需要染色和电泳分离，且仅能进行定性分析，难以准确定量，并且容易受到污染影响，产生假阳性，限制了其应用。而荧光定量PCR技术不仅能进行定量，而且具备高灵敏度、特异性和可靠性，自动化程度高且无污染，因此逐渐取代了传统PCR。

在PCR扩增的初期阶段，荧光信号变化较小，接近于一条直线，称为基线。基线可以自动生成或手动设置。随后进入指数增长期，这个阶段扩增曲线表现出高度的重复性。在此阶段，我们可以设定一条荧光阈值线，通常设置为前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。当每个反应管中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值，且这个值与起始浓度的对数呈线性关系，具有良好的重现性。

CT值的主要意义在于计算目标基因的表达量，通常涉及“绝对定量”和“相对定量”两个概念。绝对定量旨在测定目标基因在样本中的分子数量，而相对定量则测定目标基因在不同样本之间的相对比例，无需知道每个样本中的拷贝数。虽然CT值可以用来计算这两种定量结果，但绝对定量实验需要使用已知拷贝数的标准品，必须制作标准曲线；而相对定量则可以选择不制作标准曲线。因此，因获取绝对标准品的困难，多数实验室会选择使用相对定量方法来计算基因的表达量。

荧光定量PCR的应用范围广泛，自其发明以来，为生物科学的发展做出了重要贡献，主要包括以下领域：

• 核酸定量分析：用于传染病的定量分析，病原微生物或病毒的检测，例如甲型H1N1流感、转基因动植物基因拷贝数检测及RNAi基因失活率测定。
• 基因表达差异分析：比较不同处理样本中特定基因的表达差异，例如药物处理和化学处理等。
• SNP检测：通过检测单核苷酸多态性，研究个体对不同疾病的易感性，或对特定药物的反应。
• 甲基化检测：评估DNA甲基化状态与人类疾病尤其是癌症之间的关系，改进检测方法以提高灵敏度。
• 产前诊断：非侵入性地从孕妇外周血中分离胎儿DNA，利用实时荧光定量PCR检测性别决定基因。
• 病原体检测：对多种病原体进行定量，改善灵敏度和检测效率。
• 药物疗效评估：分析与乙肝和丙肝病毒相关的药物疗效。
• 肿瘤基因检测：检测肿瘤相关基因中突变的存在及其表达量，有助于肿瘤的早期诊断和监测。

总的来说，尊龙凯时荧光定量PCR的创新应用为现代生物医学研究和临床诊断提供了强有力的工具，推动了相关领域的发展与进步。